α-1,2-聚焦轉(zhuǎn)移酶的制備方法有哪些


α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,2-聚焦轉(zhuǎn)移酶)的制備方法主要包括以下幾種:
一、基因工程方法
基因克隆與表達(dá):
從特定生物體(如幽門螺旋桿菌)中提取α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,并將其定向插入到原核表達(dá)載體(如pET-22b(+))中,構(gòu)建重組表達(dá)載體。
將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等宿主細(xì)胞中,通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白。
突變體構(gòu)建:
通過(guò)對(duì)α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變,獲得具有更高酶活力或更穩(wěn)定性質(zhì)的突變體。
二、蛋白質(zhì)純化方法
親和層析:
利用重組表達(dá)載體上所帶的組氨酸標(biāo)簽等親和標(biāo)簽,通過(guò)Ni2?-NTA親和層析等純化方法進(jìn)一步純化目的蛋白。
其他純化方法:
根據(jù)目的蛋白的性質(zhì),還可以采用離子交換層析、分子篩層析等其他純化方法進(jìn)一步純化目的蛋白。
三、發(fā)酵與誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化
發(fā)酵條件優(yōu)化:
通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的成分、發(fā)酵溫度、pH值、溶氧量等發(fā)酵條件,提高α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量。
誘導(dǎo)表達(dá)方式優(yōu)化:
采用不同的誘導(dǎo)表達(dá)方式(如溫度誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)等)和誘導(dǎo)劑濃度,優(yōu)化目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程。
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